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TSA fluorescence doppio kit di colorazione Tyramide Segnali amplificazione Amplificazione immunofluorescenza Reagente

Specifica: 100t.
  • G1235-100T.
  • Servicebio

Descrizione del prodotto

Kit di colorazione a doppio fluorescenza TSA

Cat No. G1235-100T.

Contenuto del pacco:

Numero articolo del prodotto

nome del prodotto

Specifiche

Kit di colorazione a doppio fluorescenza TSA

G1226-100T.

100t.

Introduzione al prodotto:

Questo prodotto Il kit di colorazione a doppia fluorescenza TSA è adatto per la doppia colorazione immunofluorescenza delle sezioni di paraffina, in particolare per la doppia fluorescenza immunolabeling di anticorpi primari della stessa fonte, e può anche essere utilizzato per la doppia fluorescenza immunolabeling di anticorpi da diverse fonti. Il principio principale si basa sull'amplificazione del segnale di tiramide (TSA, dell'amplificazione del segnale di tiramide), in appresso denominata tecnologia TSA. Il principio principale della tecnologia TSA è di utilizzare la reazione di perossidasi della tiramide (cioè, il sale di tiramide etichettato fluorescente forma un sito legante covalente in HRP catalizzato da H2O2) per produrre un gran numero di reazioni enzimatiche. Questo prodotto può interagire con i residui di proteine ​​circostanti (incluso il triptofano, l'istidina e i residui della tirosina) si combinano per formare una grande quantità di deposizione di fluorescein nel sito di rilegatura antigene anticorpale per raggiungere l'amplificazione del segnale. È inoltre possibile utilizzare diverse tiramine fluorescenti per ottenere più colorazione fluorescente ripetendo più volte immunolabeling.

I dati dello spettro di fluorescenza dei coloranti fluorescenti pertinenti dei kit di colorazione fluorescenti della serie TSA sono i seguenti:

Tipo di tintura fluorescente

EX / EM.

Fitc-tiramide.

492/518.

CY3-Tyramide.

555/569.

IF488-Tyramide.

491/516.

IF555-Tyramide.

557/570.

IF647-Tyramide.

656/670.

Condizioni di archiviazione:

I pacchetti di ghiaccio trasportati, negozio a -20 ° C, periodo valido è di 6 mesi.

Composizione

Numero di componenti

Componente

G1235-100T.

Conservazione

G1235-1.

Fitc-tiramide.

2 × 25 μl

-20 ℃.

G1235-2.

CY3-Tyramide.

2 × 25 μl

-20 ℃.

G1235-3.

Diluente della tiramide

50 ml

4 ℃.

G1235-4.

Dapi (pronto all'uso)

20 ml

4 ℃.

G1235-5.

Tissue Autofluorescence Quenchere una soluzione

20 ml

Temperatura ambiente

G1235-6.

Tessuto Autofluorescence Thancher B Soluzione

20 ml

Temperatura ambiente

G1235-7.

Thancher anti-fluorescenza

10 ml

-20 ℃.

Preparazione prima dell'esperimento:

1. Preparare il tampone PBS 0,01 MOL / L (PH7.0-7.4, consigliato G4202 o G0002), 3% H2O2 e 0,3% H2O2;

2. Preparare anticorpi primario e corrispondente anticorpo secondario con etichetta HRP, soluzione di recupero dell'antigene (scegliere la soluzione di recupero dell'antigene appropriato in base al tipo di anticorpo e tessuto);

3. Secondo il dosaggio, preparare la soluzione di lavorazione della tintura TSA secondo il seguente rapporto.

Soluzione di lavorazione della colorazione TSA

Articolo del reagente

Volume

Soluzione di colorazione TSA-FITC

Diluente della tiramide

1 ml

0,3% H2O2.

10 μl.

Fitc-tiramide.

2 μl.

Soluzione di colorazione TSA-CY3

Diluente della tiramide

1 ml

0,3% H2O2.

10 μl.

CY3-Tyramide.

2 μl.

Nota: dopo che la tiramide fluorescente è fusa, centrifugare per un breve periodo, e quindi prenderlo dopo la miscelazione con consigli per la pipetta pulita. Si consiglia di preparare la soluzione di lavorazione della colorazione TSA per l'uso immediato. Dovrebbe essere immagazzinato a 4 ° C e protetto dalla luce, ed è efficace entro 24 ore.

Passi

Assunzione di diapositive dei tessuti come esempio, l'acqua nei seguenti passaggi sperimentali è l'acqua pura.

1. Deparaffinizzare le sezioni del tessuto in acqua;

2. Recupero dell'antigene: in base all'anticorpo primario utilizzato e al tipo di campione, utilizzare un metodo appropriato per eseguire il recupero dell'antigene sulla sezione del tessuto.

3. Lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta, usa una PAP Pen per cerchiare e segnare il tessuto;

4. Aggiungere 100 μL TISSUE Autofluorescence Thancher Una soluzione a caduta del tessuto, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare per 5 minuti;

5. Attivazione della perossidasi endogena: aggiungere il 3% H2O2 alla sezione per coprire il tessuto e incubare al buio a temperatura ambiente per 25 minuti, per bloccare la perossidasi endogena per ridurre la colorazione di sfondo non specifica. Lavare 3 volte con 1 × PBS, 5 minuti ogni volta;

6. Blocco: dopo che le diapositive sono leggermente essiccate, il 3% BSA o il siero viene aggiunto a goccia a castonatura per sigillare per 30 minuti. Il reagente di blocco è determinato secondo le specie dell'anticorpo primario e dell'anticorpo secondario;

7. Incubare l'anticorpo primario: diluire l'anticorpo primario a una concentrazione appropriata con 1 × PBS o una soluzione di blocco (G2010 si consiglia). Scuotere delicatamente la soluzione di blocco sulla sezione, aggiungere l'anticorpo primario diluito a goccia a goccia per coprire il tessuto e posizionare la sezione piatta in una scatola di camera umida con acqua e incubare durante la notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con 1 × PBS, 5 minuti ogni volta;

8. Incubare l'anticorpo secondario etichettato da HRP: diluire l'anticorpo secondario a una concentrazione appropriata con 1 × PBS o una soluzione di blocco (consigliata G2010), aggiungere l'anticorpo secondario a goccia al tessuto e incubare a temperatura ambiente per 50 minuti. Lavare 3 volte con 1 × PBS, 5 minuti ogni volta;

9. Aggiungi una soluzione di lavorazione della colorazione TSA-FITC 50-100μl al tessuto per garantire che il tessuto sia completamente coperto e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare con 1 × PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

10. Trattamento a microonde: la sezione del tessuto è posizionata in una scatola di riparazione piena di soluzione di recupero dell'antigene (scegliere la soluzione di recupero antigene appropriata in base al tipo di tessuto e anticorpo) per il trattamento del riscaldamento a microonde per rimuovere gli anticorpi primari e secondari rilegati. In questo passaggio, è necessario prevenire i fiocchi secchi causati da eccessiva evaporazione liquida.

11. Ripetere il passaggio 7 per incubare il secondo anticorpo primario: diluire il secondo anticorpo (anticorpo primario) da testare con PBS (o altro diluente anticorpale) a una concentrazione appropriata. Scuotere delicatamente il liquido sulla sezione, aggiungere l'anticorpo diluito a goccia a goccia per coprire il tessuto e posizionare la sezione piatta in una scatola umidificata con acqua e incubare durante la notte a 4 ° C. Lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

12. Ripetere il passaggio 8 per incubare il corrispondente anticorpo secondario HRP: diluire l'anticorpo secondario a una concentrazione appropriata con PBS (o altro diluente anticorpale), aggiungere l'anticorpo secondario a caduta del tessuto e incubare a temperatura ambiente per 50 minuti. Lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

13. Aggiungere una soluzione di lavorazione della colorazione TSA-CY3 a 50-100μl del tessuto per garantire che il tessuto sia completamente coperto e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

14. Continuazione del nucleo con DAPI: dopo leggermente essiccate le sezioni, aggiungere una soluzione di colorazione DAPI (prêt-oni to-uk) ai tessuti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare con PBS 3 volte, 5min ogni volta;

15. Tessuto Autofluorescenza Esplorazione: Aggiungi tessuto Autofluorescenza Thancher B Soluzione B Greadwise al tessuto, incubato a temperatura ambiente per 5 minuti e risciacquare con acqua corrente per 3 minuti;

16. Montaggio e esame microscopico: dopo che le sezioni vengono essiccate leggermente essiccate, aggiungere il dischi anti-fluorescenza per montare le diapositive. Osservare e raccogliere immagini con un microscopio a fluorescenza o un microscopio laser confocale. Le fette possono essere conservate per 15 giorni a 4 ° C in una casella di scorrimento a prova di luce.

Precauzioni

1. Rispetto all'anticorpo secondario fluorescente, il kit TSA ha una maggiore sensibilità e un segnale più forte. Pertanto, la concentrazione dell'anticorpo primario deve essere ridotta, generalmente da 5-10 volte sulla base del rapporto di diluizione consigliato nel manuale anticorpale, per ridurre la fluorescenza di sfondo causata da un legame non specifico. Si consiglia di impostare la concentrazione del gradiente dell'anticorpo primario per ottenere l'effetto migliore.

2. Se la fluorescenza di sfondo è forte, si consiglia di aggiungere il fase di spegnimento dell'autofluorescenza del tessuto.

3. Il rapporto di diluizione raccomandato della tirica fluorescente è 1: 500, e il rapporto di diluizione può essere regolato in base ai risultati sperimentali (la gamma Raccordo di diluizione raccomandata è 1: 200-1: 1000).

4. Per un'etichettatura fluorescente multipla, si consiglia di incubare prima l'anticorpo policlonale, quindi incubare l'anticorpo monoclonale; Incubare l'anticorpo corrispondente alla proteina target a bassa abbondanza, quindi incubare l'anticorpo corrispondente alla proteina target ad alta abbondanza.

G1235-100TA.Reagente -1 (1)downloadimimg.Fetta 13.Fetta 12.Fetta 10.


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