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Kit di rilevamento BRDU per rilevamento del DNA

Volume:50t.

  • G4102-50t.
  • Servicebio

Descrizione del prodotto

Informazioni sul prodotto

nome del prodotto

Gatto. No.

Specifiche

Kit di rilevamento Brdu.

G4102-50t.

50t.

G4102-100T.

100t.

Introduzione al prodotto:

Questo kit di rilevamento del BRDU del prodotto viene utilizzato per il rilevamento della proliferazione cellulare di celle e sezioni di tessuto. Brdu (5-Bromo-2-deoxyuridina), che è 5-bromodeoxyuridina, è un analogo di tymidina (T). Il principio di questo kit è che BRDU può sostituire la Thymidine T per competizione. Immettere la fase di sintesi del DNA (fase S). Quando BRDU è incorporato nelle celle in divisione vigorosa, le celle contenenti BRDU possono essere rilevate utilizzando anticorpi anti-BRDU e anticorpo Ligase o fluoresceina come sistema di indicatore e combinato con altri marcatori di cellule per la doppia etichettatura, la proliferazione delle cellule può essere giudicata Tipi, velocità di proliferazione, ecc. Sono di grande significato per lo studio delle dinamiche cellulari. Brdu entra nelle cellule del tessuto attraverso l'iniezione intravitale o la coltura cellulare e il DNA incorporato in esso è posizionato accuratamente, il che può riflettere efficacemente il livello di DNA di nuova sintesi nelle cellule S-Phase, ed è meno influenzata dall'ambiente interno ed esterno della cella , e l'etichetta non andrà persa.

Stoccaggio e trasporto

Trasporto di sacchetto di ghiaccio (ghiaccio bagnato); fluido di rottura, fluido di blocco (3% BSA), 1 m HCL può essere immagazzinato a 4 ° C, il 4% paraformaldeide può essere immagazzinato a temperatura ambiente, anti-BRDU (mouse mAb) deve essere conservato a -20 ° C, scadenza Data 12 mesi.

Componente

Numero di componenti

Componente

G4102-50t.

G4102-100T.

G4102-1.

Rupture Fluid.

30 ml

30 ml

G4102-2.

Fluido di tenuta (3% BSA)

30 ml

30 ml

G4102-3.

4% paraformaldeide

30 ml

30 ml

G4102-4.

1 m hcl.

30 ml

30 ml

G4102-5.

Anti-BRDU (mouse mAb)

50 μl.

100 μl.

Manuale dell'utente del prodotto

1 pc

1 pc

Preparazione dell'esperimento

1. Porta il proprio buffer PBS (consigliato G4202), anticorpo secondario, etanolo sfumato, tablet di montaggio, ecc.;

2. Porta la tua soluzione di colorazione nucleare, raccomandare G1004 Ematoxylin Macchia o G1012 DAPI Macchia (pronto all'uso);

3. Preparare la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU: Diluire Anti-BRDU (mouse mAb) con soluzione di blocco (3% BSA) 100 volte per preparare la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU, prepararlo per l'uso corrente, conservare a 4 ℃;

4. Soluzione di lavoro anticorpi secondario: preparare il proprio HRP-Etichettato (successivo rilevamento della luce bianca, kit di colori DAB, consigliato G1212) o fluorescentemente etichettato (successivo rilevamento della fluorescenza) anticorpo anticordio anti-mouse, e diluire con PBS per preparare il fluido di lavoro anticorpale secondario .

Passi di funzionamento:

Campione cellulare:

1. Preparazione delle celle: preparare le diapositive cellulari in anticipo per garantire che le cellule siano in condizioni normali e aderiscano bene;

2. Incubazione BRDU: le celle sono incubate con il mezzo contenente BRDU in un incubatore al buio per un certo periodo di tempo. La concentrazione di BRDU e il tempo di incubazione delle cellule sono diverse a seconda del tipo di cella. Si consiglia di esplorare le migliori condizioni nel pre-esperimento. Le condizioni sperimentali delle cellule testate nelle precauzioni sono per riferimento;

3. Fissaggio delle cellule: le celle sopra menzionate sono state incubate con BRDU e lavate 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Aggiungere 1 ml del 4% paraformaldeide all'orifizio per coprire le cellule e fissare per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

4. Permeabilità: aggiungere il fluido di rottura all'orifizio per coprire le celle per 8-10 minuti, lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

5. Colorazione nucleare (opzionale):

Per il successivo rilevamento della luce bianca, macchia il nucleo cellulare con ematossilina: aggiungere la soluzione di colorazione di ematoxylin alla piastra di pozzo per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione di colorazione dell'ematossilina e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti;

Per il successivo rilevamento della fluorescenza, macchia il nucleo cellulare con DAPI: aggiungi la soluzione DAPI Dye alla piastra di pozzo per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione DAPI Dye e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta;

6. Ri-fissaggio: aggiungere il 4% paraformaldeide a castonatura alla piastra del pozzo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta;

7. ACCIDIFICAZIONE: aggiungere 1 m HCL a castonatura alla piastra del pozzo per coprire le celle, trattare a 37 ° C per 10 minuti, lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta;

8. Post-fixation: aggiungi il 4% paraformaldeide a castonatura alla lastra di nuovo, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

9. Blocco: aggiungere la soluzione di blocco (3% BSA) a caduta della lastra e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Assorbire e scartare la soluzione di blocco, non pulire;

10. Incubazione anticorpale Anti-BRDU: aggiungere la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU a caduta della piastra pozzo per coprire le cellule e incubare durante la notte a 4 ° C. Aspirare e scartare la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU, lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

11. Incubazione anticorpale secondaria: rilasciare la soluzione di lavoro anticorpo secondaria nella piastra del pozzo per coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aspirare e scartare la soluzione di lavoro dell'anticorpo secondario e lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta. Si noti che se si utilizza un anticorpo secondario fluorescentemente etichettato, è necessario evitare la luce durante l'incubazione e il lavaggio;

12. Rivestimento e esame microscopico:

Se è un anticorpo secondario etichettato da HRP, utilizzare il reagente cromogenico DAB (consigliato G1212) per sviluppare il colore del campione cellulare, della disidratazione e della trasparenza. Utilizzare una pinzetta appuntita per raccogliere delicatamente la diapositiva e montarlo capovolto su una diapositiva di vetro pulita. , Osservazione del microscopio;

Se si tratta di un anticorpo secondario fluorescentemente etichettato, rilasciare un supporto di discesa anti-fluorescenza (è consigliabile G1401) sulla diapositiva in vetro pulita, raccogliere delicatamente la diapositiva con pinzette appuntite, fibbia capovolta sul vetro scivola e montare la diapositiva, osservare con un microscopio a fluorescenza;

Campioni di sezione dei tessuti:

1. Preparazione degli animali: preparare gli animali sperimentali in anticipo e eseguire l'etichettatura BRDU in vivo, fare riferimento a WGB8010. Dopo l'etichettatura in vivo, prendere materiali, fissare e preparare sezioni di paraffina in base alle esigenze sperimentali;

2. Le sezioni di paraffina del tessuto sono deparaffinizzate e reidratate;

3. Riparazione: gruppo Il pennello per cerchiare il tessuto, immergere la fetta nella soluzione di recupero antigene e riparare con il riscaldamento a microonde. Raffreddamento naturale

4. Colorazione nucleare (opzionale):

Per il successivo rilevamento della luce bianca, macchia il nucleo cellulare con ematossilina: aggiungere la soluzione di colorazione di ematoxylin alla piastra di pozzo per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione di colorazione dell'ematossilina e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti;

Per il successivo rilevamento della fluorescenza, macchia il nucleo cellulare con DAPI: aggiungi la soluzione DAPI Dye alla piastra di pozzo per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione DAPI Dye e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta;

5. Ripensazione: aggiungere il 4% paraformaldeide a castonatura al tessuto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta;

6. Acidificazione: aggiungere 1 m HCL alle fette per coprire i tessuti, trattarli a 37 ° C per 10 minuti, lavarli con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

7. Post-fixation: aggiungere il 4% paraformaldeide a castonatura alla piastra ben pozzo e incubare per 10 minuti, lavare con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta;

8. Spegnimento perossidasi endogeni (opzionale): aggiungere il 3% H2O2 a goccia a fette e incubare a temperatura ambiente per 25-30 minuti per rimuovere la perossidasi endogena. Quindi le fette sono state lavate 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta;

9. Blocco: aggiungere la soluzione di blocco (3% BSA) alle fette per coprire il tessuto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere il fluido di blocco, non pulire;

10. Incubazione anticorpale anti-BRDU: aggiungere la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU alle fette per coprire il tessuto e incubare durante la notte a 4 ° C. Rimuovere la soluzione di lavoro anticorpo primario anti-BRDU, lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta;

11. Incubazione anticorpale secondaria: aggiungere la soluzione di lavoro dell'anticorpo secondario alla sezione per coprire il tessuto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Rimuovere la soluzione di lavoro dell'anticorpo secondario, lavare 3 volte con PBS, 5 minuti ogni volta. Si noti che se si utilizza un anticorpo secondario fluorescentemente etichettato, è necessario evitare la luce durante l'incubazione e il lavaggio;

12. Rivestimento e esame microscopico:

Se è un anticorpo secondario etichettato da HRP, utilizzare il reagente cromogenico DAB (consigliato G1212) per sviluppare il colore della sezione del tessuto, disidratare, trasparente e osservare sotto il microscopio dopo il montaggio;

Se si tratta di un anticorpo secondario fluorescentemente etichettato, aggiungere tavolette di montaggio a discesa anti-fluorescenza a goccia (consigliata G1401) per montare e osservare con un microscopio a fluorescenza.

Osservazione dei risultati

Se rilevato con anticorpo secondario etichettato da HRP, il nucleo è blu scuro, e le cellule proliferanti sono marroni. Se è un anticorpo secondario fluorescente etichettato, il nucleo mostrerà la fluorescenza blu (ex = 358 nm, em = 461 nm), e le celle proliferanti mostreranno la fluorescenza dell'anticorpo secondario corrispondente.

Appunti:

1. Per i campioni di diapositiva cellulare, il tempo di concentrazione e di elaborazione di BRDU sono relativi ai tipi di cella. In generale, la concentrazione e il tempo necessari per trattare le cellule tumorali sono bassi. Le cellule con proliferazione lenta come fibroblasti o cellule epiteliali devono aumentare la concentrazione e prolungare il tempo di azione. L'intervallo di concentrazione consigliato è di 20-100 μm e il tempo di azione è di 40 minuti. -4 ore, può essere regolato in base ai tipi di cellule specifici.

La seguente tabella mostra la concentrazione di trattamento cellulare comunemente utilizzata e il tempo testato, solo per riferimento.

Cellula

Concentrazione di Brdu (μm)

Tempo di incubazione (min)

A549.

40

40

Hela.

40

40

Nrk-52e.

40

40

Skov3.

80

120

H9C2.

40

40

2. Al fine di garantire i migliori risultati sperimentali, si consiglia di utilizzare altri reagenti di supporto prodotti dalla nostra azienda: Ematoxylin Stain (G1004); Macchia daPI (G1012); Kit reagente colore DAB (G1212), compresse di montaggio a discesa anti-fluorescenza (G1401);

3. Per la tua sicurezza e salute, si prega di indossare cappotti di laboratorio e guanti monouso per il funzionamento.

Il prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, non per la diagnosi clinica!

G4102-50t.Reagente -1 (1)downloadimimg.Fetta 12.Fetta 13.Fetta 10.Fetta 14.

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