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DNA Ligase 2 × In-fusion cloning Mix Molecolare Biologia Biologia Reagente

Specifica: 100t.
  • G3350-100T.
  • Servicebio
  • Servicebio.

Descrizione del prodotto

G3350-100T.

Introduzione:

2 × Miscela di clonazione in-fusion in-fusion può rapidamente legare e clonare singoli o 2 ~ 3 frammenti multipli nel vettore. È particolarmente adatto per la legame singolo frammento e l'efficienza di 2-3 legatura del frammento sarà ridotta. Utilizzare qualsiasi metodo per linearerizzare il vettore e introdurre la sequenza finale del vettore linearizzato al Primer di amplificazione in avanti / indietro del frammento del DNA inserito nel vettore linearizzato, in modo che i 5 \" Il prodotto di amplificazione PCR è rispettivamente è una sequenza (15-25 BP) coerente con la fine del vettore linearizzato. Nel 2 × In-Fusion Cloning Mix Premix, mescolare il prodotto PCR con la stessa sequenza ad entrambe le estremità del vettore linearizzato e il vettore linearizzato in una certa proporzione, e quindi incubare su ghiaccio (o in una miscela di ghiaccio e acqua) Per 5 minuti, è possibile trasformare celle competenti e completare la clonazione direzionale.

Questo premiscelo può ottenere la clonazione senza soluzione di continuità efficiente e rapida del DNA. E può essere utilizzato per la costruzione di plasmidi ricombinanti o plasmidi ricombinanti della mutazione del punto genico. La premix non dipende dal sistema Ligase, riducendo notevolmente lo sfondo dell'auto-legatura vettoriale, e allo stesso tempo, non è necessario considerare i siti di endonuclease di restrizione contenuti nell'inserto stesso. Per la costruzione di plasmidi ricombinanti del DNA del singolo segmento, la percentuale di cloni positivi ottenuti utilizzando questo premix è al 99%. L'uso di questo premix non si basa su apparecchiature a temperatura costante e tutte le operazioni dalla preparazione del campione del DNA alla trasformazione e la placcatura dei prodotti ricombinanti possono essere completate entro poche ore, che risparmia notevolmente il tempo.

Stoccaggio e trasporto

Trasporto con ghiaccio bagnato; Stoccaggio a -20 ° C, valido per 12 mesi.

Componente

G3350-10T.

G3350-20T.

G3350-100T.

2 × Mix di clonazione in-fusion

50 μl.

100 μl.

5 × 100 μl

PUC19 (linearizzato, vettore di controllo, 5 ng / μl)

-

10 μl.

10 μl.

Inserto di controllo (10 ng / μl)

-

10 μl.

10 μl.

Manuale d'uso

1

Sistema di reazione (sistema di reazione 10 μl consigliata)

Componente

Volume

2 × Mix di clonazione in-fusion

5 μl.

Vettore

X μl.

Segmento del DNA.

Y μl.

Acqua senza nucleasi

Aggiungere a 10 μl

Condizioni di reazione

Bagno idrico da ghiaccio (miscela di ghiaccio), reagire per 5-10 minuti.


Conversione del prodotto di reazione

1. Rimuovere le celle competenti (come E.Coli DH5α, E.Coli TOP10, ecc.) Dal frigorifero a -80 ° C e disgustarli sul ghiaccio.

2. Aggiungere il campione reagito allo stato competente, muovere delicatamente il fondo del tubo con le dita da mescolare e il bagno in ghiaccio per 30 minuti.

3. Il prodotto viene quindi posizionato in un bagno di acqua a 42 ° C per riscaldare per 90 secondi. Dopo il completamento, viene immediatamente posizionato sul ghiaccio e immerso nel ghiaccio per 2-5 minuti.

4. Prendere 900 μl di SOC o LB sterile e aggiungerlo al tubo EP. Dopo la miscelazione, posizionare il tubo EP su uno shaker e incubarsi a 220 giri / min a 37 ° C per 1 ora per recuperare i batteri (può anche essere collocato in un incubatore di 37 ° C per la cultura del luogo statico per 1 ora);

5. Secondo i requisiti sperimentali, attirare diversi volumi di cellule competenti trasformate e aggiungerle al terreno solido LB contenente i corrispondenti antibiotici, diffondere le cellule uniformemente, e dopo il liquido è completamente assorbito, posizionare la piastra capovolta in un 37 ° C Incubatore e coltivare durante la notte.

Identificazione di cloni positivi

Le colonie monoclonali coltivate sul piatto vengono raccolte per l'identificazione del PCR della colonia, o dopo la coltura, il plasmide viene estratto dalla digestione della restrizione o dall'identificazione PCR, o il plasmide estratto è direttamente sequenziato e analizzato per l'identificazione.

Precauzioni

1. Il frammento vettoriale e target deve essere purificato da gel ed elettroforesi per rilevare la loro qualità e concentrazione. Quando la concentrazione è bassa, non è necessario aggiungere acqua e usarlo direttamente per il trucco.

2. Il valore TM tra le regioni sovrapposte di più frammenti deve essere coerente e> 60 ° C.

3. Si raccomanda che il rapporto molare del vettore da inserire sia 1: 1 ~ 1: 3; Quando sono collegati 2-3 frammenti, il rapporto molare tra ciascun frammento è 1: 1 e l'efficienza di legatura di 2-3 frammenti sarà ridotta. Il sistema di reazione della legatura può essere ridimensionato in proporzioni uguali. .

4. Quando il volume totale del vettore e dell'inserto è maggiore di 5 μl, il sistema di reazione può essere amplificato a 20 μl.

5. Il volume del prodotto di organizzazione non deve superare 1/10 del volume della cella competente, altrimenti l'efficienza della trasformazione sarà significativamente ridotta. Il volume del prodotto di liginio e la cella competente possono essere aumentati nella stessa proporzione (come 20 μl del sistema di formazione per trasformare 200 μl di cellule competenti).

6. 2 × Si consiglia di comprimere la miscela di clonazione in fusione quando viene utilizzato quando viene utilizzato e restituito a -20 ° C immediato dopo l'uso. Dopo lo scongelamento, può essere diviso in pacchetti e congelato per ridurre i tempi di congelamento e scongelamento ripetuti.

7. Quando viene utilizzato l'elettroporazione per la trasformazione, il prodotto di reazione deve essere purificato per metodo di colonna o metodo di precipitazione di etanolo.

G3350-100T.downloadimimg.Fetta 12.Fetta 13.Fetta 10.Fetta 14.

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