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DAB (SA-HRP) Kit di rilevamento Apoptosi a cellule Tunel Apoptosi 100t Kit di preparazione della biologia cellulare

Volume: 100t.

  • G1507-100T.
  • Servicebio

Descrizione del prodotto


Informazioni sul prodotto:

Nome del prodotto

Gatto. No.

Volume

DAB (SA-HRP) Kit di rilevamento Apoptosi a cellule TUNEL

G1507-50t.

50t.

G1507-100T.

100t.

Descrizione del prodotto:

La rottura del DNA cromosomiale in apoptosi è un processo graduale. Il DNA cromosomico è il primo degradato in grandi frammenti di 50-300 kb sotto l'azione di nucleasi endogeni, e poi circa il 30% del DNA cromosomico è sotto l'azione dell'endonuclease di CA2 + e MG2 + -Dependent. Sono tagliati a caso per formare il polimero del DNA nucleosomiale del 180-200 BP. Pertanto, nella fase tarda dell'apoptosi, il DNA sarà degradato in frammenti da 180-200 BP e un gran numero di 3 estremi oh verrà esposto sul DNA genomico rotto. Il terminale deossinucleotidyl transferasi (TDT) è una polimerasi DNA indipendente dal modello-indipendente che può catalizzare il legame dei deossinucleotidi alle estremità 3'-oh delle molecole di DNA rotte. Pertanto, TWT (TDT mediadia il kit di rilevamento della cella Apoptosis Dutp Nick) può essere utilizzato per rilevare la rottura del DNA nucleare delle cellule del tessuto nella fase tarda dell'apoptosi. Il principio è che sotto l'azione dell'enzima TDT, l'etichettato Biotina-Etichettato DUTP (Biotin-Dutp) è incorporato nell'estremità 3'-Oh esposta quando il DNA genomico è rotto, e poi la perossidasi di rafano (perossidasi del rafano-cavallo, HRP) etichettata Streptavidina (Streptavidin-HRP, SA-HRP), rileva la fine del DNA etichettato con biotina e infine esegue la reazione a colori aggiungendo la miscela di substrato HRP (DAB), in modo che il nucleo delle cellule apoptotiche sia colorato marrone, che può essere rilevato dall'ordinario Microscopio ottico. Questo kit ha una vasta gamma di applicazioni ed è adatta per il rilevamento dell'apoptosi cellulare nelle sezioni del tessuto di paraffina, sezioni di tessuto congelato, diapositive cellulari, macchie cellulari, ecc.

Stoccaggio e trasporto

Trasporto di sacchetto di ghiaccio (ghiaccio bagnato);

Questo kit è memorizzato a -20 ° C e ha un periodo di validità di 12 mesi.

Componente:

Numero di componenti

Componente

G1501-50t.

G1501-100T.

G1507-1.

ENZIME TDT ricombinante

50 μl.

2 × 50 μl

G1507-2.

Mix di etichettatura Biotin-Dutp

250 μl.

2 × 250 μl

G1507-3.

Buffer di equilibrio

5 × 1 ml

10 × 1 ml

G1507-4.

Streptavidin-hrp.

25 μl.

2 × 25 μl

G1507-5.

Proteinasi K (200 μg / ml)

1 ml

2 × 1 ml

Manuale dell'utente del prodotto

1 pc

Preparazione prima dell'esperimento:

1. Si consiglia il tampone fosfato PBS (G0002 o G4202);

2. Soluzione di fissaggio: il 4% paraformaldeide disciolto in PBS o altro sistema buffer, PH 7.4 (G1101 è raccomandato);

3. Soluzione di rottura della membrana: 0,1% Triton X-100 disciolto in 0,1% Citrato di sodio (G1204 è raccomandato);

4. Preparare PBS contenente lo 0,2% di Triton X-100; Preparare PBS contenente lo 0,1% Triton X-100 e 5 mg / ml BSA;

5. Per la colorazione del nucleo, è necessario portare il proprio DAPI (2 μg / ml) o PI (1 μg / ml) (G1012, G1021 sono raccomandati);

6. Se hai bisogno di un esperimento di controllo positivo, è necessario portare il proprio dnase I (G3342 è raccomandato)

7. Se si utilizza un citometro a flusso, preparare la propria macchia PI (consigliata G1021) e rnase A (Dnase Free) (consigliato G3413);

8. Si prega di indossare il camice da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.

Passi di funzionamento:

I. Preparazione del campione

A. Sezioni di tessuto incorporato da paraffina

1. Immergere la sezione del tessuto di paraffina in xilene a temperatura ambiente per 5-10 minuti, ripetere 2-3 volte; Quindi immergere in assoluto etanolo per 5 minuti, ripetere due volte; Infine, utilizzare l'etanolo sfumato (85%, 75%, doppio vapore) acqua) immergere ogni volta una volta, ogni volta per 5 minuti;

2. Risciacquare delicatamente la sezione con PBS e rimuovere il liquido in eccesso attorno al campione; Utilizzare una penna istochimica per disegnare un piccolo cerchio con una distanza di 2-3 mm dal tessuto lungo il contorno esterno del tessuto per facilitare la trasformazione a valle di permeabilità e le operazioni di marcatura del saldo; Durante l'esperimento, non lasciare asciugare il campione e mettere il campione trasformato in una scatola umida per mantenere il campione umido;

3. Preparare la soluzione di lavoro della proteinasi K: soluzione di protezione proteinasi K (200 μg / ml) con PBS come diluente in un rapporto 1: 9 per rendere la concentrazione finale di 20 μg / ml;

4. Aggiungere 100 μl della soluzione di lavoro proteinasi K sopra menzionata a ciascun campione per renderlo tutto coperto e incubare a 37 ° C per 20 minuti;

(Nota: il trattamento della proteinasi K è utile principalmente per la permeazione dei reagenti di colorazione nelle successive passaggi dei tessuti e delle cellule. Il tempo di incubazione troppo lungo o breve influenzerà la successiva efficienza dell'etichettatura. Per ottenere risultati migliori, il tempo di incubazione della proteinasi K può essere ottimizzato)

5. Infiltratare e pulire il campione con la soluzione PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta che (la proteinasi K deve essere lavata pulita, altrimenti interferire con la successiva reazione di etichettatura) e posizionerà il campione elaborato in una casella umida per mantenere il campione umido;

6. (passo facoltativo) Rimuovere il liquido in eccesso sul campione, aggiungere una quantità appropriata di fluido di rottura (0,1% tritone X-100 nel citrato di sodio dello 0,1%) al tessuto, infiltrata completamente il tessuto e trattalo a temperatura ambiente per 20 minuti; Dopo aver completato il trattamento della rottura, il campione viene risciacquato con la soluzione PBS 3 volte per 5 minuti ogni volta; Il campione trattato è posizionato in una scatola umida per mantenere l'umidità del campione.

B. Sezione congelata del tessuto

1. Immergere le diapositive nella soluzione paraformaldeide al 4% (disciolta in PBS) per la fissazione e incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente;

2. Dopo che il film viene portato fuori dal fissativo, lasciarlo asciugare naturalmente in un cappuccio di fumi;

3. Risciacquare le diapositive in acqua pura o PBS per rimuovere la soluzione fissativa rimanente sulle diapositive;

4. Utilizzare una penna istochimica per disegnare un piccolo cerchio 2-3 mm a parte il tessuto lungo la periferia del tessuto per facilitare la lavorazione della permeabilità a valle e le operazioni di marcatura; Durante l'esperimento, non lasciare asciugare il campione, e il campione trasformato mantiene il campione umido in una scatola umida;

5. Preparare la soluzione di lavoro della proteinasi K: soluzione di diluta proteinasi K (200 μg / ml) Soluzione azionaria con PBS come diluente in un rapporto di 1: 9 per effettuare la concentrazione finale di 20 μg / ml;

6. Aggiungere 100 μl della soluzione di funzionamento della proteinasi K sopra menzionata a goccia a ciascun campione in modo che sia completamente coperto e incubato a temperatura ambiente per 10 minuti;

(Nota: il trattamento della proteinasi K aiuta principalmente i tessuti e le cellule a permeare i reagenti di colorazione nei passaggi successivi. Se il tempo di incubazione è troppo lungo o troppo corto, influenzerà la successiva efficienza dell'etichettatura. Se non si ottengono risultati migliori, l'incubazione Il tempo di proteinasi K potrebbe dover essere ottimizzato)

7. Risciacquare il campione 2-3 volte con la soluzione PBS Per rimuovere il liquido in eccesso (la proteinasi K deve essere lavata pulita, altrimenti interferire con la successiva reazione di etichettatura) e posizionerà il campione elaborato in una casella umida per mantenere il campione umido ;

8. (fase opzionale) Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di rottura (0,1% tritone X-100 disciolto nel citrato di sodio dello 0,1%) al tessuto, infiltrata completamente il tessuto e trattalo a temperatura ambiente per 20 minuti. Lo stesso vale a dire dopo che il trattamento della rottura è completato. Risciacquare il campione con la soluzione PBS per rimuovere il liquido in eccesso e posizionare il campione elaborato in una casella umida per mantenere l'umidità del campione.

C. Film di arrampicata cellulare

1. Coltivare le cellule aderenti sulle diapositive della camera Lab-Tek. Dopo il trattamento di induzione dell'apoptosi, sciacquare delicatamente le diapositive due volte con PBS;

2. Aggiungere una quantità appropriata del 4% di soluzione paraformaldeide (disciolta in PBS) a ciascuna camera di scorrimento per la fissazione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente;

3. Rimuovere il fissativo, aggiungere PBS e lavare 3 volte, 5 minuti ogni volta;

4. Ogni campione è immerso nella soluzione TRITON X-100 dello 0,2% preparato in PBS e incubato per 5 minuti a temperatura ambiente per la permeabilizzazione;

5. Immergere e pulire il campione 2-3 volte in un becher aperto riempito con soluzione PBS;

6. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso, e disattivare con cautela il liquido attorno al campione sulla diapositiva con carta da filtro. Il campione trasformato è posizionato in una scatola umida per mantenere l'umido del campione.

D. Cell Smear.

1. Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di circa 2 × 107 celle / ml, pipetta 50-100 μl di sospensione cellulare sulla diapositiva in vetro antigoccia e utilizzare una vetrina pulita per diffondere delicatamente la sospensione cellulare;

2. Immergere le diapositive in un barattolo di colorazione contenente paraformaldeide preparato al momento del 4% in PBS, fissare le cellule e posizionarle a 4 ° C per 25 minuti;

3. Immergere la diapositiva in PBS, lasciarlo a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi ripetere una volta;

4. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e disattivare con cautela il liquido in eccesso attorno al campione sulla diapositiva con carta da filtro. Utilizzare una penna istochimica per disegnare un piccolo cerchio lungo la periferia della cella per facilitare la lavorazione della permeabilità a valle di permeabilità e le operazioni di marcatura. Durante l'esperimento, non lasciare asciugare il campione;

5. Ogni campione è immerso nella soluzione TRITON X-100 dello 0,2% preparato in PBS e incubato a temperatura ambiente per 5 minuti per la permeabilizzazione;

6. Immergere e pulire il campione 2-3 volte in un becher aperto riempito con soluzione PBS;

6. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e utilizzare la carta da filtro per assorbire con cautela il liquido attorno al campione sulla diapositiva. Il campione trasformato è posizionato in una scatola umida per mantenere l'umido del campione.

II. Dnase I Treatment Control Control Experiment (fase opzionale)

Dopo che il campione è permeabilizzato, trattare il campione con DNase I (consigliato G3342) per preparare un controllo positivo.

1. Aggiungere 100 μl 1 × Dnase I Buffer (Metodo di preparazione: prendi 10 μl 10 × DNase I Buffer, quindi aggiungere 90 μl di acqua deionizzata da mescolare) a castoppo sul campione permeato e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti;

2. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro contenente DNASE I (20 U / ML) (Metodo di preparazione: prende 10 μl 10 × Dnase I Buffer, quindi aggiungere 2 μl DNase I, quindi aggiungere 88 μl di mix di acqua deionizzati ), incubare a temperatura ambiente per 10 minuti;

3. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e lavare le diapositive 3-4 volte in un barattolo di colorazione riempito con PBS.

(Nota: è necessario utilizzare un serbatoio di colorazione separato per le diapositive di controllo positive, altrimenti il ​​residuo DNASE I sulle diapositive di controllo positivo può introdurre un alto sfondo sulle diapositive sperimentali)

III. Marcatura e test

1. Equilibrio: aggiungere 50 μl di buffer di equilibrio a ciascun campione per coprire l'area campione da testare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti;

2. Preparazione della soluzione di etichettatura: scongelamento della miscela di etichettatura e di etichettatura DURP di etichettatura cf640-dutp sul ghiaccio, e seguire il rapporto di enzima del TDT ricombinante: CF640-DUTP Etichettatura MIX: BUFFER DI EQUILIBRAZIONE = 1 μL: 5 μl: 50 μL (1: 5: 50 ) Mescolare abbastanza buffer di incubazione TDT per tutti gli esperimenti. Il volume dei reagenti utilizzato in specifici esperimenti può essere regolato in una proporzione appropriata in base alle dimensioni della diapositiva;

3. Sistema di controllo negativo: preparare un tampone di incubazione TDT di controllo senza enzima TDT ricombinante e sostituirlo con DDH2O;

4. Etichettatura: Prova a rimuovere il buffer equilibrato equilibrato, quindi aggiungere 56 μl di buffer di incubazione TDT a ciascun campione di tessuto e incubare a 37 ° C per 1 ora; Fai attenzione a non asciugare le diapositive e le diapositive devono essere protette dalla luce;

5. Risciacquare immediatamente il campione del tessuto con PBS per 4 volte, 5 minuti ogni volta;

6. Pulire delicatamente la soluzione PBS attorno al campione con carta da filtro;

7. Colorazione nucleare: il campione è macchiato nel serbatoio di colorazione e la diapositiva è immersa nel serbatoio di colorazione contenente la soluzione DAPI (appena preparata e diluita con PBS) al buio, e lasciato a temperatura ambiente per 8 minuti;

8. Montaggio: dopo il campione è macchiato, lavare il campione del tessuto 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Quindi rimuovere delicatamente il liquido in eccesso, aggiungere tavolette di montaggio a discesa anti-fluorescenza a goccia (consigliata G1401) a Montare;

7. Esame microscopico: analizzare immediatamente il campione sotto un microscopio a fluorescenza e la diapositiva deve essere protetta dalla luce. DAPI può macchiare sia cellule apoptotiche che non apoptotiche in blu, e solo nel nucleo apoptotico può esserci fluorescenza rosa localizzata dall'incorporazione di CF640-Dutp.

IV. Utilizzare la citometria del flusso per rilevare le cellule di sospensione

1. Lavare le celle da testare due volte con PBS, centrifuga a 4 ° C (500 g) e risospendere in 500 μl PBS;

2. Fissazione: aggiungere 5 ml di soluzione paraformaldeide dell'1% preparata con PBS al campione, fissare le cellule e posizionare su ghiaccio per 20 minuti;

3. Centrifugare le celle a 300 g per 10 minuti a 4 ° C, rimuovere il surnatante e risospendere il doppio di 5 ml PBS, e infine risospendere le cellule in 500 μl PBS;

4. Permessibilizzazione: aggiungere 5 ml del 70% di etanolo pre-raffreddato su ghiaccio al campione e incubare a -20 ° C per 4 ore per permeare le cellule;

(Nota: le celle possono anche essere permeabilizzate con lo 0,2% di Triton X-100 in soluzione PBS a temperatura ambiente per 5 minuti)

5. Dopo la centrifugazione a 300 g per 10 minuti, le cellule sono state risospese in 5 ml di Pbs e risospese in 1 ml PBS dopo la centrifugazione;

6. Equilibrio: trasferimento di circa 2 × 106 celle a un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, centrifuga a 300 g per 10 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in 80 μl di buffer di equilibrio e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti;

7. Preparazione della soluzione di etichettatura: disconoscimento CF640-DURP Etichettatura del tampone e del buffer di equilibrio sul ghiaccio e seguire il rapporto tra enzima ricombinante TDT enzimatico: CF640-DUTP Etichettatura MIX: tampone di equilibrio = 1 μl: 5 μl: 50 μl (1: 5: 50) mescolare abbastanza buffer di incubazione TDT per tutti gli esperimenti e reazioni di controllo positive opzionali;

8. Etichettatura: Le cellule sono state centrifugate a 300 g per 10 minuti, il supernatante è stato rimosso e il pellet è stato risospeso in 56 μl di tampone di incubazione TDT e incubato a 37 ° C per 1 ora, protetto dalla luce. Risospendere delicatamente le cellule con una micropipetta ogni 15 minuti;

9. Dopo aver completato la reazione, aggiungere 1 ml di 20 mm EDTA per fermare la reazione e mescolare delicatamente con una micropipetta;

10. Centrifuga a 300 g per 10 minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 ml della soluzione TRITON X-100 dello 0,1% preparato con PBS, che contiene 5 mg / ml BSA e lavare due volte;

11. Colorazione nucleare: centrifuga a 300 g per 10 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in una soluzione DAPI da 0,5 ml contenente 250 μg di Rnase senza dnase A. Incubare le celle per 30 minuti a temperatura ambiente al buio;

12. Rilevamento a bordo: analisi della citometria del flusso delle cellule, DAPI può macchiare sia cellule apoptotiche che non apoptotiche in blu, e solo nel nucleo cellulare apoptotico può esserci fluorescenza rosa localizzata dall'incorporazione di CF640-Dutp.

Cinque, il diagramma di processo sperimentale

V. Diagramma di processo sperimentale

G1507-100T.

Reagente -1 (1)

Attenzione:

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, non per la diagnosi clinica!

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