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Click-it Kit di rilevamento proliferazione cellulare EDU-594

Volume: 100t.

  • G1603.
  • Servicebio

Descrizione del prodotto

Introduzione al prodotto:

È un metodo di valutazione comune e importante nelle scienze della vita per determinare l'influenza di alcuni geni, droghe, ecc. Sulle cellule coltivate in vitro analizzando la capacità di proliferazione cellulare o analizzando la crescita e la capacità di rinnovo delle singole cellule del tessuto in diverso condizioni o interventi di stimolazione. . Esistono molti metodi per rilevare la proliferazione cellulare. La maggior parte di loro usano alcuni enzimi metabolici prodotti dalle cellule per valutare indirettamente l'attività di proliferazione delle cellule (come il metodo CCK-8, il metodo MTT, ecc.), Ma alcuni farmaci o fattori come lo stato della cellula stessa avranno un certo impatto sui risultati della valutazione. Il rilevamento diretto della sintesi del DNA nelle cellule per determinare la proliferazione cellulare è riconosciuta come il metodo di rilevamento più accurato ed efficace. Tuttavia, sia il metodo di incorporazione del nucleoside radiomarcato originale e il successivo miglioramento del metodo BRDU basato sul rilevamento anticorpo ha i propri limiti.

EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridina, 5-ethynyl-2'-deoxyuridina) è un analogo di tymidina contenente un gruppo di acetilene, quando iniettato in animali o celle in incubazione coltivati ​​in vitro, queste piccole molecole possono rapidamente diffondere a vari organi e tessuti e infiltrarsi nelle cellule e possono sostituire la timidina (T) nel DNA appena sintetizzato durante la proliferazione cellulare. Il gruppo di acetilene nella molecola EDU può reagire con la sonda composta azide etichettata fluorescente per formare un anello di triazole stabile sotto la catalisi degli ioni di rame, quindi il DNA recentemente sintetizzato può essere etichettato con la sonda fluorescente corrispondente. Rispetto al metodo di incorporazione del nucleoside radiomarcato, il metodo di rilevamento EDU non ha fattori limitanti come la contaminazione radioattiva; Rispetto al metodo di rilevamento BRDU, il metodo di rilevamento EDU non richiede un trattamento denaturazione del DNA o la reazione antigene-anticorpo, che riduce notevolmente la complessità dell'esperimento e del tempo, diventa anche più risparmio di tempo, più sensibile, più stabile e più accurato . Questo kit può essere utilizzato per rilevare la proliferazione cellulare nelle cellule coltivate o nei tessuti animali in vitro. La sonda fluorescente in questo kit è la fluorescenza rossa, la lunghezza d'onda massima di eccitazione è di 593 nm e la lunghezza d'onda massima delle emissioni è 614 Nm. Dopo che le celle proliferanti sono etichettate, il nucleo cellulare mostrerà una fluorescenza rossa brillante. Il nucleo cellulare è etichettato congiuntamente con la colorante nucleare convenzionale corrispondente (questo kit fornisce la tintura nucleare cella di Hoechst 33342), è possibile utilizzare il microscopio a fluorescenza, il microscopio confocale laser e altri strumenti per osservare direttamente la proliferazione cellulare; È inoltre possibile utilizzare la citometria del flusso per rilevare l'intensità della fluorescenza delle celle coltivate in vitro e giudicare il ciclo cellulare in base all'attività di replica del DNA di intensità della fluorescenza nella fase MID-S.

Stoccaggio e trasporto

Trasportato in ghiaccio bagnato; immagazzinato a -20 ° C nel Dark, il reagente catalitico EDU (reagente A) e il tampone di reazione può essere immagazzinato a 4 ° C; Valido per 12 mesi.

Numero di componenti

Componente

G160.3-100t.

G1603-1.

Soluzione di stoccaggio EDU (10 mm)

100 μl.

G1603-2.

Reagente catalitico (reagente A)

120 μl.

G1603-3.

Dye fluorescente IF488 (reagente B)

50 μl.

G1603-4.

Additivi catalitici (reagente c)

2 × 100 mg (polvere)

G1603-5.

Buffer di reazione

20 ml

G1603-6.

Soluzione di colorazione Hoechst 33342

30 μl.

Manuale dell'utente del prodotto

1 pc

Nota: i tempi di reazione sopra riportati corrispondono al rilevamento della lastra di 96 pozzetti.

Preparazione dell'esperimento

1. Mezzo di coltura cellulare contenente siero;

2. Soluzione di permeabilizzazione: la soluzione tampone contenente 0,2-0,5% tritone X-100 (è raccomandata il G1204);

3. Soluzione di fissaggio: 4% paraformaldeide (consigliato G1101) o altri reagenti per scopi simili;

4. Il buffer PBS (è raccomandato G4202);

5. Acqua ultra-pura;

6. Reagenti relativi a sezione di modellazione e tessuto animale (rilevamento della proliferazione delle cellule del tessuto animale).

Passi di funzionamento:

1. Preparazione dei campioni di cellule in vitro e reagenti:

1.1. Piantare le cellule uniformemente nella piastra di coltura cellulare a una certa densità (la densità di piantatura è determinata da fattori come dimensioni della cella, velocità di crescita, ecc.). Dopo che le celle aderiscono al muro o tornare a uno stato normale, eseguire corrispondenti stimoli di stimolazione dei farmaci e altri trattamenti (come test delle cellule di sospensione, seguire il normale metodo di funzionamento delle celle di sospensione, l'intero esperimento deve aggiungere passaggi come la centrifugazione).

1.2. Centrifugare l'additivo catalitico (reagente c) a bassa velocità, aggiungere 1 ml di acqua ultrapura per dissolverla e conservarla a -20 ℃ per uso successivo.

2. Etichettatura EDU, fissaggio e permeabilizzazione delle cellule in vitro:

2.1. Preparare 2 × EDU Soluzione di lavoro di incubazione: aggiungere 2 μl di soluzione di stoccaggio EDU (10 mm) ad ogni 1 ml di mezzo di coltura cellulare completa, che è una soluzione di funzionamento dell'incubazione di 20 μm 2 × EDU e metterlo nell'incubatore per preriscaldare (è raccomandato che il pre-esperimento sia esplorato con la concentrazione di funzionamento EDU di 10 μm);

2.2. Nella modalità di mezzo mezzo che cambia, la metà aspirata della metà della coltura cellulare originale nel piatto di coltura e aggiungere un volume uguale di soluzione di lavoro preriscaldata di 2 × EDU e incubare per un certo periodo di tempo (il tempo di incubazione dipende in generale sulla crescita delle cellule corrispondenti il ​​ciclo di solito rappresenta circa il 10% del tempo di ciclo cellulare. Per le cellule più aderenti e in rapida crescita, si consiglia di incubare per circa 2 ore. Per condizioni specifiche, deve essere regolato in base al caratteristiche cellulari e condizioni effettive dopo il trattamento. Se è necessario un'incubazione più lunga può ridurre in modo appropriato la concentrazione di funzionamento EDU; per un tempo più breve, la concentrazione di EDU può essere aggiornata in modo appropriato);

2.3. Dopo che il campione di cella con etichetta EDU viene lavato con buffer PBS per 1-2 volte, aggiungere la soluzione fissativa per coprire le celle e fissare a temperatura ambiente per 15 minuti (se è necessario il rilevamento del flusso, aderire alle celle prima di questo passaggio Digestione e risospensione, fissarlo, quindi seguire il metodo di elaborazione delle celle di sospensione); Lavare 2-3 volte con il buffer PBS, ogni volta per 3-5 minuti;

2.4. Rimuovere il buffer PBS, aggiungere permeato per coprire le celle o i tessuti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti;

2.5. Dopo aver rimosso il permeato, lavare 1-2 volte con il buffer PBS per 3-5 minuti ogni volta, e quindi andare al passaggio 4.

3. Elaborazione della sezione di modellazione del tessuto e del tessuto dell'ADU dell'ADU:

3.1. Secondo i requisiti sperimentali, una o più iniezioni EDU sono utilizzate per modellare gli animali da iniezione intraperitoneale, iniezione intramuscolare, iniezione sottocutanea, iniezione sottocutanea, iniezione della coda, ecc. Generalmente, il rapporto tra dosaggio EDU al peso corporeo animale è 5 mg / kg. Iniezione specifica L'importo dipende dal contenuto di ricerca e dalle condizioni degli animali. Parte della soluzione di stoccaggio EDU è fornita in questo kit, che viene utilizzato principalmente per l'etichettatura in vitro cellulare EDU. Se è necessario modellare gli animali con EDU, è possibile ordinare il reagente EDU separatamente (è raccomandato G5059);

3.2. L'intestino tenue e altre cellule del tessuto epiteliale proliferano le cellule del tessuto veloce e del cervello proliferano lentamente. I tessuti più veloci di solito richiedono meno di 12 ore per segnare, mentre il tessuto a crescita più lento può richiedere diversi giorni per il marchio; Il miglior tempo di marcatura si basa su a seconda dell'esperimento specifico, poiché il piccolo tessuto epiteliale intestinale prolifera rapidamente, si consiglia di utilizzare questo tipo di tessuto come riferimento di etichette;

3.3. Dopo che gli animali modellati vengono messi a morte secondo gli standard prescritti, i tessuti richiesti sono estratti, e le sezioni congelate o le sezioni di paraffina sono fatte in base alle procedure convenzionali;

un. Per le sezioni congelate: tornare a temperatura ambiente, aggiungere una quantità appropriata di fissativo e fissare a temperatura ambiente per 15 minuti. Rimuovere il fissativo e lavare 3 volte con una quantità appropriata di buffer PBS per 3-5 minuti ciascuno; Rimuovere il buffer PBS e coprire il tessuto con una quantità appropriata di soluzione di permeabilizzazione e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti; Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione e lavare 1 con buffer PBS -2 volte, 3-5 minuti ogni volta, quindi andare al passaggio 4.

B. Per le sezioni di paraffina: Deparaffinize e reidratare le sezioni e lavare con PBS per 5 minuti. Rimuovere il buffer PBS, aggiungere permeato per coprire le cellule o i tessuti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti; Dopo aver rimosso il permeato, lavare 1-2 volte con il buffer PBS per 3-5 minuti ogni volta, e quindi andare al passaggio 4.

4. EDU Fare clic su Risposta:

4.1. Durante la fissazione e la perforazione della cella o del tessuto, preparare la soluzione di reazione click (per diversi sistemi di preparazione del campione, fare riferimento allo schema nella tabella seguente)

Per le celle coltivate in vitro: questo passaggio di riferimento corrisponde al volume e al dosaggio di 10 campioni di piastre da 10 96 pozzetti (100 μl per pozzetto). L'importo della preparazione può essere aumentato o diminuito in proporzione ai requisiti di utilizzo. Si prega di aggiungere i componenti nell'ordine mostrato nella tabella seguente. Aggiungi lato e mescolare bene (preparato e usato ora);

Componente

Volume

Buffer di reazione

935 μl.

Reagente catalitico (reagente A)

10 μl.

Dye fluorescente IF594 (reagente B)

5 μl.

Additivi catalitici (reagente c)

50 μl.

Capacità totale

1000 μl.

Per le fette di cellule del tessuto: fare riferimento al seguente sistema per la preparazione del sistema di soluzione di reazione del clic. L'importo della preparazione può essere aumentato o ridotto in proporzione al numero di campioni di taglio. Ogni campione di fetta è coperto con circa 100-200 μl di soluzione di reazione di click.

Componente

Volume

Buffer di reazione

928 μl.

Reagente catalitico (reagente A)

10 μl.

Dye fluorescente IF594 (reagente B)

12 μl.

Additivi catalitici (reagente c)

50 μl.

Capacità totale

1000 μl.

4.2. Rimuovere il buffer PBS del passaggio precedente (passaggio 2,5 o 3.3), aggiungere la soluzione di reazione click, agitare delicatamente per garantire che la soluzione di reazione copre tutte le cellule o i tessuti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio;

4.3. Rimuovere la soluzione di reazione Fare clic e lavare 2-3 volte con il buffer PBS per 3-5 minuti ogni volta (se non ci sono altri requisiti speciali, è possibile utilizzare la citometria del flusso per rilevare l'intensità della fluorescenza o utilizzare altri strumenti per rilevare l'effetto di fluorescenza) .

5. Colorazione nucleare:

5.1. Rimuovere il buffer PBS nel passaggio precedente, diluire la soluzione di colorazione Hoechst 33342 e il buffer PBS a un rapporto di 1: 500-1000, aggiungere le cellule di copertura e incubare per 5 minuti;

5.2. Rimuovere la soluzione di colorazione Hoechst 33342 e lavare 2-3 volte con il buffer PBS per 3-5 minuti ogni volta.

6. Analisi di imaging e rilevamento

Posizionare direttamente le celle coltivate o le taglie a fetta del tessuto in un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale per analizzare la proporzione di cellule proliferanti; Oppure raccogliere le celle coltivate in vitro e utilizzare un citometro a flusso per rilevare l'intensità della fluorescenza (si consiglia di utilizzare un campione di cella con etichetta EDU viene utilizzato come controllo negativo per il rilevamento della citometria del flusso e la tensione appropriata è selezionata). Secondo l'intensità della fluorescenza, può essere giudicata l'attività di replica del DNA nella fase S del ciclo cellulare. Le corrispondenti caratteristiche spettrali del colorante fluorescente IF594 (reagente B) di questo kit sono EX / EM: 593 NM / 614 Nm (rosso); Le corrispondenti caratteristiche spettrali della soluzione di colorazione Hoechst 33342 sono EX / EM: 346 Nm / 460 Nm (blu).

Appunti:

1. Per le celle coltivate in vitro, la specifica concentrazione di EDU e il tempo di incubazione possono essere regolati in modo appropriato a seconda del campione e dello scopo della ricerca.

2. Alcune cellule del tessuto proliferano lentamente. Per eliminare i fattori come effetti di modellazione scadenti, si consiglia di selezionare campioni di tessuto con proliferazione rapida come campioni di riferimento (come il tessuto intestinale).

3. Se il colore di sfondo è troppo scuro, può essere causato da un impotente lavaggio nell'esperimento, troppo lungo tempo di fissaggio del campione di tessuto e fissativo residuo.

4. Il reagente di aggiunta catalitico EDU (reagente c) è facile da ossidare. Cerca di evitare l'esposizione prolungata all'aria. Dopo essere stato preparato in una soluzione acquosa, si consiglia di memorizzare in aliquota; Dopo il test, se il colore del reagente di addizione catalitico EDU cambia leggermente, il sistema catalitico di reazione del clic rimane lo stesso che può procedere normalmente. Se appare marrone, indica che il componente è scaduto, quindi per favore scartarlo.

5. Si prega di indossare il camice da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, non per la diagnosi clinica!

G1603.Reagente -1 (1)downloadimimg.Fetta 13.Fetta 12.Fetta 10.Fetta 14.

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