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AllegatoIn V-EGFP / PI Kit di rilevamento Apoptosi cellulare per citometria a flusso o microscopia a fluorescenza

Volume: 50t.

Stato di disponibilità:
  • G1510-50t.
  • Servicebio

Descrizione del prodotto

Informazioni sul prodotto:

Nome del prodotto

Gatto. No.

Volume

AllegatoIn V-EGFP / PI Kit di rilevamento apoptosi a cellule PI

G1510-50t.

50t.

G1510-100T.

100t.

Descrizione del prodotto:

L'apoptosi è un normale processo fisiologico che si verifica nel processo di sviluppo embrionale e mantenimento dell'omeostasi dei tessuti. È accompagnato da molti cambiamenti morfologici. Tra questi, la perdita della membrana cellulare è una delle prime caratteristiche dell'apoptosi. Nelle cellule normali, la fosfotidilserina (PS) è distribuita solo sul lato interno del bilayer fosfolipidico della membrana cellulare. Tuttavia, nella fase iniziale dell'Apoptosi, PS si capovolgerà dal lato interno della membrana lipidica al lato esterno, esponendolo all'esterno della cella. Allegato V (Allegato-V) è una proteina fosfolipida fosfolipida di CA2 + -Dependent che ha un'elevata affinità per PS e si lega specificamente alle cellule esposte a PS. Pertanto, l'annebbiamento V viene utilizzato come uno degli indicatori per rilevare l'apoptosi delle cellule precoci. Lo ioduro di propidio (PI) è una tintura di acido nucleico. Non può penetrare le cellule normali con le membrane cellulari intatte e le prime cellule apoptotiche, ma possono penetrare le membrane cellulari della tarda cellulare apoptotica e necrotica e macchia il nucleo.

Questo prodotto utilizza EGFP (proteina fluorescente verde migliorata) e allegati V per formare una proteina di fusione come sonda di rilevamento per rilevare l'apoptosi cellulare precoce. Allo stesso tempo, PI è usato per distinguere le cellule sopravvissute da cellule apoptotiche necrotiche e tardive. Quando Allegato-V-EGFP viene utilizzato in combinazione con PI, le cellule viventi mostrano colorazione negativa (Allegato-V- / PI-), le cellule apoptotiche precoci mostrano una singola fluorescenza positiva (allegato V + / PI-), e le cellule apoptotiche in ritardo e le cellule necrotiche mostrano dual Positivo fluorescenza (allegato V + / PI +). Questo kit è adatto per la citometria del flusso o il rilevamento del microscopio a fluorescenza. Allo stesso tempo, poiché EGFP e Allegato V sono fusibili 1: 1, questo prodotto può anche rilevare quantitativamente le cellule apoptotiche.

Stoccaggio e trasporto

Trasporto di sacchetto di ghiaccio (ghiaccio bagnato);

Questo kit è memorizzato a -20 ° C e ha un periodo di validità di 12 mesi.

Componente:

Numero di componenti

Componente

G1510-50t.

G1510-100T.

G1510-1.

Allegata V-EGFP

250 μl.

2 × 250 μl

G1510-2.

IODUDIO DI PROPIDIO (PI)

250 μl.

2 × 250 μl

G1510-3.

1 × tampone vincolante

25ml.

2 × 25 ml

Manuale dell'utente del prodotto

1 pc

Passi di funzionamento:

1. Celle di sospensione: prendere la sospensione cellulare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 g per 5 minuti a 4 ° C;

Celle aderenti: prima raccogliere il supernatante della coltura cellulare. Dopo la digestione con tripsina priva di EDTA (consigliata G4002), si combinano con il supernatante della coltura cellulare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 g per 5 minuti a 4 ° C. Il tempo di digestione della tripsina non dovrebbe essere troppo lungo, in modo da evitare un'eccessiva digestione e causare falsi positivi.

2. Lavare le cellule due volte con PBS pre-raffreddamento (consigliato G4202) e raccomandare le cellule per centrifugazione a 500 g ogni volta per 5 minuti a 4 ° C;

3. Risospendere delicatamente le celle nel buffer pre-rilassante 1 × legante e regolare la concentrazione della cella a 1 ~ 5 × 106 / ml;

4. Dai 100 μl di sospensioni cellulari, aggiungere 5 μL di allegata in V-EGFP e 5 μl PI, mescolare delicatamente e proteggere dalla luce a temperatura ambiente per 8-10 min;

5. Aggiungere 400 μl di buffer pre-refrigerato 1 × Binding, agitare delicatamente ed eseguire il rilevamento con un citometro a flusso o microscopio a fluorescenza entro 1 ora.

Analisi dei risultati

1. Flusso citometria

un. Selezionare la tensione appropriata e regolare la compensazione della luce durante il rilevamento e l'analisi della citometria del flusso. Si consiglia di impostare un controllo negativo (non etichettato con l'annesso V-EGFP e PI) per regolare la tensione, ad eccezione del gruppo sperimentale e di un controllo a singola etichetta (aggiungere solo l'allegato) V-EGFP e le cellule PI) sono usati per regolare la compensazione;

B. Esempi di riferimento del rilevamento e analisi della citometria del flusso:

Le cellule linfoma di Jurkat T sono state indotte con 5 μm Camptotecin per 6 ore. Fare riferimento alla procedura sperimentale di cui sopra e utilizzare la citometria del flusso per rilevare i risultati. I risultati sono mostrati nella figura seguente.

La lunghezza d'onda massima di eccitazione di EGFP è di 488 nm e la lunghezza d'onda massima delle emissioni è di 507 Nm; La lunghezza d'onda massima di eccitazione del complesso PI-DNA è di 535 Nm e la lunghezza d'onda massima delle emissioni è 615 Nm. Il diagramma del punto a due dispersione è stato disegnato dal software di analisi pertinente del citometro del flusso, con EGFP su Abscissa e PI sull'ordinata. In un esperimento tipico, le cellule viventi non hanno fluorescenza, e i punti sparsi sono nel primo quadrante della sinistra in basso a sinistra. Le cellule apoptotiche nella fase iniziale hanno una forte fluorescenza verde e i punti sparsi si trovano nel secondo quadrante della destra in basso a destra. Le cellule apoptotiche tardive e le cellule necrotiche mostrano la doppia fluorescenza rossa e verde doppia, e i punti sparsi si trovano nel terzo quadrante della parte superiore destra.

2. Ispezione del microscopio di fluorescenza

Aggiungere 5-10 μl di sospensione cellulare Doppia macchiare con allegato V-EGFP e PI sul vetrino, coprelo con un vetro di copertura e osservare sotto un microscopio a fluorescenza con un filtro a due colori. L'annesso V-EGFP mostra un segnale di fluorescenza verde. PI ha un segnale fluorescente rosso.

Appunti:

1. Durante l'intero esperimento, l'operazione dovrebbe essere il più delicato possibile per evitare rotture cellulari e influenzare i risultati sperimentali.

2. Lavare le cellule con PBS non può essere omessa e allo stesso tempo, rimuovere il PBS residuo il più possibile.

3. Quando si utilizza la tripsina per digerire le cellule, è necessario fare attenzione a evitare danni artificiali alle celle e controllare il tempo di digestione. Se il tempo di digestione è troppo breve, le celle devono essere soffiate per cadere per cadere, che è probabile che causi danni meccanici alla membrana cellulare; Se il tempo di digestione è troppo lungo, la membrana cellulare è anche vulnerabile al danno. Influenzare i risultati del test. Inoltre, il pancreatin contenente EDTA non può essere utilizzato. EDTA influenzerà il legame dell'allegato V e PS.

4. Dopo che le cellule aderenti vengono stimolate dall'apoptosi, se alcune delle cellule galleggiano, è necessario raccogliere il supernatante della coltura cellulare e le cellule aderenti e macchiarli allo stesso tempo, che renderà i risultati più accurati.

5. Allegata V-EGFP e PI sono sensibili alla luce, evitare la luce durante il funzionamento. Il test deve essere effettuato il prima possibile dopo la reazione.

6. Si prega di indossare abiti da laboratorio e guanti monouso durante l'esperimento per evitare la contaminazione e garantire la sicurezza.

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, non per la diagnosi clinica!

G1510-50TA.Reagente -1 (1)

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