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Allegato V-PE / 7-AAD Kit di rilevamento a cellule cellule

Volume: 50t.
  • G1512-50t.
  • Servicebio
  • Servicebio.

Descrizione del prodotto

Informazioni sul prodotto:

Nome del prodotto

Gatto. No.

Volume

Allegato V-PE / 7-AAD Kit di rilevamento a cellule cellule

G1512-50t.

50t.

G1512-100T.

100t.

Descrizione del prodotto:

L'apoptosi è un normale processo fisiologico che si verifica nel processo di sviluppo embrionale e mantenimento dell'omeostasi dei tessuti. È accompagnato da molti cambiamenti morfologici. Tra questi, la perdita della membrana cellulare è una delle prime caratteristiche dell'apoptosi. Nelle cellule normali, la fosfotidilserina (PS) viene distribuita solo sul lato interno del bilayer fosfolipido della membrana cellulare, ma nella fase iniziale dell'Apoptosi, PS capovolgerà dal lato interno della membrana lipidica al lato esterno, esponendolo all'esterno della cella. Allegato V (Allegato V) è una proteina di legame fosfolipido di ca2 + -Dependent con alta affinità per PS e applicandosi specificamente alle cellule esposte a PS. Pertanto, l'annebbiamento V viene utilizzato come uno degli indicatori per rilevare l'apoptosi delle cellule precoci. 7-AAD è una tintura di acido nucleico che può solo penetrare nella membrana cellulare della tarda cellule apoptotiche e dei morti e macchia il nucleo per segnare le cellule apoptotiche e necrotiche in ritardo.

Questo prodotto utilizza Phycoerythrin (Phycoerythrin, PE) per etichettare l'allegato V a una sonda di rilevamento per rilevare l'apoptosi cellulare precoce. Allo stesso tempo, 7-AAD è usato per distinguere le cellule di sopravvivenza da cellule apoptotiche necrotiche e tardive. L'uso combinato dell'allegato V-PE e 7-AAD, le cellule vive mostrano colorazione negativa (Allegato-V- / 7-AAD-), le celle antiche apoptotiche mostrano una singola fluorescenza positiva (Allegato V + / 7-AAD-) e cellule apoptotiche in ritardo e Le cellule necrotiche hanno mostrato una doppia fluorescenza positiva (Allegato V + / 7-AAD +). Questo kit è adatto per la citometria del flusso o il rilevamento del microscopio a fluorescenza.

Stoccaggio e trasporto

Trasporto in ghiaccio bagnato;

Conservare a 2-8 ° C al buio, valido per 12 mesi.

Componente:

Numero di componenti

Componente

G1512-50t.

G1512-100T.

G1512-1.

Allegato-V-PE

250 μl.

2 × 250 μl

G1512-2.

7-AAD.

250 μl.

2 × 250 μl

G1512-3.

1 × tampone vincolante

25 ml

2 × 25 ml

Manuale dell'utente del prodotto

1 pc

Passi di funzionamento:

1. Celle di sospensione: prendere la sospensione cellulare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 g per 5 minuti a 4 ° C;

Celle aderenti: prima raccogliere il supernatante della coltura cellulare. Dopo la digestione con tripsina priva di EDTA (consigliata G4002), si combinano con il supernatante della coltura cellulare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 500 g per 5 minuti a 4 ° C. Il tempo di digestione della tripsina non dovrebbe essere troppo lungo, in modo da evitare un'eccessiva digestione e causare falsi positivi.

2. Lavare le cellule due volte con PBS pre-raffreddamento (consigliato G4202) e raccomandare le cellule per centrifugazione a 500 g ogni volta per 5 minuti a 4 ° C;

3. Risospendere delicatamente le celle nel buffer pre-rilassante 1 × legante e regolare la concentrazione della cella a 1 ~ 5 × 106 / ml;

4. Prendi 100 μl di sospensione cellulare, aggiungere 5 μL di allegata V-PE e 5 μL 7-AAD, mescolare delicatamente e proteggere dalla luce a temperatura ambiente per 8-10 min;

5. Aggiungere 400 μl di buffer pre-refrigerato 1 × Binding, agitare delicatamente ed eseguire il rilevamento con un citometro a flusso o microscopio a fluorescenza entro 1 ora.

Analisi dei risultati

1. Flusso citometria

un. Selezionare la tensione appropriata e regolare la compensazione della luce durante il rilevamento e l'analisi della citometria del flusso. Si consiglia di impostare un controllo negativo (senza alcun marcatore) per la regolazione del controllo della tensione e dell'etichetta singola (solo allegato V-PE e aggiungere solo 7-AAD) per la regolazione e la compensazione;

B. Esempi di riferimento del rilevamento e analisi della citometria del flusso:

Le cellule del linfoma di Jurkat T sono state indotte con 5 μm CamptoThecin per 6 h. Fare riferimento alla procedura sperimentale di cui sopra e utilizzare la citometria del flusso per rilevare i risultati. I risultati sono mostrati nella figura seguente.

La lunghezza d'onda massima di eccitazione di PE è 565 Nm e la lunghezza d'onda massima delle emissioni è 578 Nm; La lunghezza d'onda massima di eccitazione di 7-AAD è di 546 nm e la lunghezza d'onda massima delle emissioni è 647 Nm. Il diagramma del punto a due dispersione è stato disegnato dal software di analisi pertinente del citometro di flusso, con PE sull'ascissa e 7-AAD sull'ordinata. In un esperimento tipico, le cellule viventi non hanno fluorescenza, e i punti sparsi sono nel primo quadrante della sinistra in basso a sinistra. Le cellule apoptotiche nella fase iniziale hanno una forte fluorescenza rossa arancione e i punti sparsi si trovano nel secondo quadrante della destra in basso a destra. Le cellule apoptotiche tardive e le cellule necrotiche presentano una doppia fluorescenza rossa arancione e rosa e i punti sparsi si trovano nel terzo quadrante della parte superiore destra.

2. Ispezione del microscopio a fluorescenza

Aggiungere 5-10 μl di sospensione cellulare Doppia macchiata con annesso V-PE e 7-AAD sulla vetrina, coprire con un bicchiere di copertura e osservare sotto un microscopio a fluorescenza con un filtro a due colori. Allegato-V-PE è un segnale fluorescente rosso arancione, 7-AAD è un segnale fluorescente rosa.

Appunti:

1. Durante l'intero esperimento, l'operazione dovrebbe essere il più delicato possibile per evitare rotture cellulari e influenzare i risultati sperimentali.

2. Lavare le cellule con PBS non può essere omessa e allo stesso tempo, rimuovere il PBS residuo il più possibile.

3. Quando si utilizza la tripsina per digerire le cellule, è necessario fare attenzione a evitare danni artificiali alle celle e controllare il tempo di digestione. Se il tempo di digestione è troppo breve, le celle devono essere soffiate per cadere per cadere, che è probabile che causi danni meccanici alla membrana cellulare; Se il tempo di digestione è troppo lungo, la membrana cellulare è anche vulnerabile al danno. Influenzare i risultati del test. Inoltre, il pancreatin contenente EDTA non può essere utilizzato. EDTA influenzerà il legame dell'allegato V e PS.

4. Dopo che le cellule aderenti vengono stimolate dall'apoptosi, se alcune delle cellule galleggiano, è necessario raccogliere il supernatante della coltura cellulare e le cellule aderenti e macchiarli allo stesso tempo, che renderà i risultati più accurati.

5. L'allegato V-PE e 7-AAD sono sensibili alla luce, si prega di evitare la luce durante il funzionamento. Il test deve essere effettuato il prima possibile dopo la reazione.

6. Si prega di indossare abiti da laboratorio e guanti monouso durante l'esperimento per evitare la contaminazione e garantire la sicurezza.

Questo prodotto è solo per scopi di ricerca scientifica, non per la diagnosi clinica!

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