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2 × Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix con tampone di diluizione del modello giallo 40 ×

  • G3326-01.

Descrizione del prodotto

Introduzione al prodotto:

Questo prodotto è una soluzione 2x Premix per il QPCR utilizzando il metodo di fluorescenza Chimerico Sybr Green I. Il componente principale, la polimerasi TAQ DNA, è una polimerasi DNA attivata termicamente bloccata per metodo anticorpale, che può inibire efficacemente l'amplificazione non specifica a bassa temperatura. Nel frattempo, combinato con il buffer di reazione ottimizzato per QPCR, la polimerasi TAQ DNA è molto adatta per un'elevata reazione di specificità e sensibilità QPCR. Una buona curva standard può essere ottenuta in un'ampia area quantitativa, che è accurata, riproducibile e affidabile per l'analisi quantitativa dei geni bersaglio. Allo stesso tempo, questo prodotto contiene uno speciale colorante di riferimento passivo Rox che è adatto per l'uso in tutti gli strumenti QPCR, e non è necessario regolare la concentrazione ROX su diversi strumenti. La tintura blu viene aggiunta nella premix, che ha l'effetto tracciante di aggiungere campioni e il diluente modello giallo viene fornito contemporaneamente. Quando il modello è diluito con il diluente modello giallo e aggiunto nella premix di reazione blu, il colore cambia dal blu al verde, che può riprodurre un ruolo di tracciante nella preparazione del processo del sistema di reazione e prevenire perdite o disadazioni. Gli spettri dei coloranti blu e gialli non si sovrappongono ai coloranti QPCR e non influenzano i risultati della reazione.

Contenuto del pacco:

Gatto. No.

Descrizione del prodotto

Volume

G3326-1.

2X Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix

1ml / 5x1ml / 15x1ml

G3326-2.

Buffer di diluizione del modello giallo 40x

1 ml.

Condizioni di conservazione:

Trasporto della borsa di ghiaccio bagnata; Immagazzinato a -20 ℃ temperatura, valido per 12 mesi.

Utilizzo:

1. (Facoltativo) Diluizione del modello

Questo kit fornisce un tampone di diluizione modello giallo 40x, una diluizione del modello giallo diluita da 40 volte diluita che può essere utilizzata per determinare con precisione se il modello è stato aggiunto al fluido di reazione QPCR cambiando il colore del liquido. Prendendo il sistema di reazione QPCR del 20UL come esempio, secondo l'importo del modello di diluizione aggiunto nella soluzione di reazione QPCR 20L, il metodo di diluizione corrispondente del modello originale può essere riferito alla tabella seguente (prendendo il modello originale diluito a 100Ul come esempio ):

Aggiungere il modello diluito alla soluzione di reazione QPCR 20L (UL)

1

2

3

4

5

6

7

8

Aggiungere il tampone di diluizione del modello giallo 40x al100UL Sistema di diluizione del modello(ul)

50

25

16.7

12.5

10

8.4

7.2

6.3

Aggiungi il sistema di diluizione del modello 100UL al modello principale (UL)

x

x

x

x

x

x

x

x

Volume di aggiunta di nucleasi - acqua libera (ul)

50-X.

75-X.

83.3-X.

87.5-X.

90-X.

91.6-X.

92.8-X.

93.7-X.

Esempio: il modello diluito a 2ULUT è necessario aggiungere al sistema di reazione QPCR del 20UL. Prendendo il sistema di diluizione del modello 100UL come esempio, quando il volume del modello originale è 20UL, il tampone di diluizione del modello giallo 25L 40L è stato aggiunto il buffer di diluizione, quindi l'acqua senza nuclease 55L è aggiunta al volume totale di 100 litri. Il buffer di diluizione del modello giallo 40x è ora 10x. Aggiungere 2UL del modello diluito in un buffer di diluizione diluizione 20UL e il buffer di diluizione del modello 40 × Final 40 × Giallo è 1x. In conclusione, il tampone di diluizione del modello giallo deve essere 1x nel sistema finale QPCR.

Nota: se il modello non deve essere diluito, o se il diluente del modello G3362-2 non è utilizzato, è possibile ignorare questo passaggio.

2. Consiglia il sistema di reazione QPCR:

Componente

20L RXN.

50L RXN.

Concentrazione finale

2 × Universal Blue Sybr Green QPCR Master Mix

10UL

25L

1 ×.

Primer in avanti (10um) a

0.4ul.

1UL.

0.2um.

Reverse primer (10um) a

0.4ul.

1UL.

0.2um.

Templateb.

Variabile

Variabile

come richiesto

Acqua senza nucleasi

Aggiungi a 20UL.

Aggiungi a 50UL


un. Di solito, un buon effetto di amplificazione può essere ottenuto con la concentrazione finale di 0.2um. Quando le prestazioni di reazione sono scarse, la concentrazione del primer può essere regolata nell'intervallo di 0,2-1.0um.

B. L'importo dell'Aggiunta del modello varia con il numero di copia del gene target nella soluzione del modello e la quantità appropriata dell'aggiunta del modello è discussa da diluizione gradiente. La migliore quantità aggiunta del DNA del modello nel sistema di reazione del 20L era inferiore a 100 ng. Quando la cDNA (soluzione di reazione RT) della reazione RT-PCR è stata utilizzata come modello, l'importo aggiuntivo non deve superare il 10% del volume totale della soluzione di reazione PCR.

3. Procedura di reazione PCR (può essere regolata secondo gli strumenti):

UN.Metodo a due passi

B. Metodo a tre passaggi

Fase

Fare un passo

Numero del ciclo

Temperatura

Time

Fase

Fare un passo

Numero del ciclo

Temperatura

Time

Fase 1

Predegenerazione

1

95 ℃.

30 sec.

Fase 1

Predegenerazione

1

95 ℃.

30 sec.

Fase 2

Degenerazione

40

95 ℃.

15 sec.

Fase 2

Degenerazione

40

95 ℃.

15 sec.

Annuncione-estensione

60 ℃.

30secͣ.

ricottura

55-65 ℃.

10 sec.




estensione

72 ℃.

30 secͣ.

Fase 3.

curva di fusione

1

Impostazioni predefinite dello strumento

Fase 3.

curva di fusione

1

Impostazioni predefinite dello strumento

A: Se la specificità dell'amplificazione deve essere migliorata, è possibile utilizzare la procedura a due punti o la temperatura di ricottura; Per migliorare l'efficienza dell'amplificazione, è possibile utilizzare una procedura in tre fasi o un tempo di estensione.

Appunti:

1. Se non è necessario il tracciamento del pipettaggio, non utilizzare il tampone di diluizione del modello giallo 40x per la diluizione del modello.

2. Prima di utilizzare il reagente, si prega di mescolarlo delicatamente su e giù delicatamente, non vorticare e oscillare per evitare bolle.

3. Quando si prepara la soluzione di reazione, metti il ​​reagente sul ghiaccio.

4. Questo prodotto contiene la colorazione fluorescente Sybr Green e la forte luce dovrebbe essere evitata quando si prepara la soluzione di reazione PCR.

5. Si prega di utilizzare un nuovo consiglio di pipetta monouso per la preparazione e il riconfezionamento del liquido di reazione per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni il più lontano possibile.

6. Evitare il mix del master di congelamento ripetuto, prova a usarlo entro un mese dopo lo scongelamento.

Compatibilità:

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, Stetone ™, Stepone PLUS ™, 7500/7500 Fast, VIIA 7 ™, QuantStudio ™ Series, PIKOREALTM KNLILER;

Stratagene: MX3000P®, 3005P ™, 4000 ™;

BIO-RAD: CFX96 ™, CFX384 ™, ICYCLER IQ ™, IQ5 ™, MYIQ ™, MINIPTICON ™, OPTICON®, OPTICON 2, CHROMO4 ™;

Eppendorf: realplex 2s, Mastercycler® EP, realplex;

IIUMINA: ECO QPCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: serie ROTOR-GENE®;

ROCHE: serie Lightcycler ™;

Takara: serie di dadi per ciclisti termali;

Analytikjena: serie Qtower;

Qtower: serie di lineeGene.

Principi di Primer Design:

1. La lunghezza del prodotto di amplificazione è consigliabile per essere compresa tra 80-300 BP;

2. Lunghezza del primer: 18-25 BP;

3. Il contenuto della base G + C in primer dovrebbe essere compreso tra il 40% -60%;

4. La differenza del valore TM tra primer in avanti e primer in retromarcia è inferiore a 2 ℃ e il valore TM compreso tra 58-62 ℃ è il migliore;

5. Casualità della distribuzione della base;

6. I primer avevano meglio non contenere sequenze auto-complementari, altrimenti formano una struttura di forcella secondaria;

7. Non ci dovrebbero essere più di 4 basi complementari o omologhe tra due primer, altrimenti verrà formato il primer dimer, in particolare la sovrapposizione complementare alla fine 3 ';

8. La base terminale 3 'del primer è suggerita per essere G o C;

9. Nessun altro prodotto non specifico è stato trovato nei risultati del confronto NCBI.

Problemi e soluzioni comuni:

Descrizione del problema

Possibili ragioni

Soluzioni

Alla fine della reazione, nessuna curva di amplificazione è apparsa o il valore CT è apparso troppo tardi

La concentrazione del modello è troppo bassa

Ripeti l'esperimento per ridurre il multiplo del modello di diluizione e iniziare dalla massima concentrazione quando la concentrazione del campione è sconosciuta

Degrado del modello

Il modello è stato preparato di nuovo e l'esperimento è stato ripetuto


Ci sono inibitori di PCR nel sistema

Generalmente, il modello viene effettuato, il rapporto di diluizione del modello è aumentato o il modello con elevata purezza è ripristinato e ripetuto


I primer possono degradare

I primer che non sono stati utilizzati per un lungo periodo dovrebbero prima essere testati per l'integrità per l'elettroforesi della pagina per escludere la possibilità di degradazione


Bassa efficienza di amplificazione

ncrease la concentrazione del primer, prova una procedura di amplificazione in tre fasi, o ridisegnare il primer


Il prodotto di amplificazione è troppo lungo

La lunghezza del prodotto dell'amplificazione è stata controllata nell'intervallo 80-300 BP


Il controllo bianco mostra il segnale

Inquinamento del sistema di reazione

Innanzitutto, l'acqua di controllo in bianco dovrebbe essere sostituita. Se si verifica ancora la stessa situazione, i primer, gli aspiratori e i tubi PCR devono essere sostituiti o dovrebbe essere avviato un nuovo mix principale. Il sistema di reazione è preparato in un tavolo super pulito per ridurre l'inquinamento aerosol

Amplificazione non specifica come i dimeri di primer appaiono

Generalmente, è normale che i prodotti di amplificazione appaiano nel controllo in bianco dopo 35 cicli, che dovrebbero essere analizzati con la curva di fusione.

Redesign Primer, regolare la concentrazione del primer o ottimizzare la procedura di reazione PCR


La curva di fusione ha più picchi

Il design del primer è scarso

Il nuovo primer è stato re-progettato secondo i principi del Primer Design

La concentrazione di primer è troppo alta

Ridurre la concentrazione del primer in modo appropriato


C'è una contaminazione genomica nel modello di cDNA

La soluzione RNA estratta viene digerita utilizzando enzimi DNA, come DSDNase, per rimuovere la contaminazione genomica o per progettare i primer transintron


Scarsa riproducibilità degli esperimenti

L'errore di aggiungere il campione è grande

L'uso di pipetta accurata, con pipetta accurata della testa di aspirazione di alta qualità;

Modello di altissima diluizione, aggiungendo modello di grande volume per ridurre l'errore di campionamento;

Il volume di reazione di QPCR è stato ingrandito

La concentrazione del modello è troppo bassa

Ripeti l'esperimento per ridurre i tempi di diluizione del modello


Deviazione della temperatura in diverse posizioni dello strumento QPCR

Calibrare regolarmente lo strumento QPCR


La curva di amplificazione non è liscia

Il segnale di fluorescenza è troppo debole, prodotto dopo la correzione del sistema

Assicurarsi che i coloranti premiscelati nel master mix non siano degradati;

Sostituire il segnale fluorescente per raccogliere materiali di consumo di QPCR migliori

Curva di amplificazione si interrompe o scivola

La concentrazione del modello era più alta e il valore di endpoint di base è stato maggiore del valore CT

L'endpoint di base (valore CT -3) è stato ridotto e i dati sono stati rianalizzati

Le curve di amplificazione dei pozzi individuali improvvisamente sono diminuiti bruscamente

Ci sono bolle nel tubo di reazione

Assicurarsi che il mix sia completamente dissolto e non vorticoso e oscillare in modo uniforme;

Dopo che il campione viene aggiunto, le bolle vengono rimosse mediante centrifugazione con luce elastica.

Il tempo pre-denaturazione è stato esteso a 10 minuti per rimuovere le bolle

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